明星IVD原料——T7 RNA聚合酶

2022/5/19 10:38:10
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疫情的不可控制，防不胜防，让新冠疫苗研发走上了巅峰时刻。其中不得不提的就是爆款IVD原料-----T7 RNA polymerase。

什么是T7 RNA polymerase？

T7RNA聚合酶（英语：T7 RNA Polymerase）是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。该酶对T7启动子具有高度特异性，不识别其它生物来源的启动子。

T7 RNA polymerase能以含有T7启动子序列的双链DNA为模板，以NTPs为底物，合成与启动子下游单链DNA互补的RNA，因此，T7 RNA polymerase常应用于体外合成长转录本和短转录本。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA polymerase的转录模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。

此酶在合成RNA的过程中，需要DNA模板与镁离子（Mg2+）作为辅因子。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及精胺（spermidine）对此酶具促进效果。与细菌的RNA聚合酶的差异之一，在于T7RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素（rifampicin）抑制。

T7 RNA polymerase用途

用于合成单链RNA以作为杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定，反义RNA合成。

作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析。

体外合成dsRNA、siRNA、miRNA等RNA。

可以识别修饰的核苷酸，例如生物素标记、荧光素标记、放射性同位素、地高辛标记dNTP，用于各种标记RNA的合成，进行下游实验。

用于体外合成转录本

常见问题及解决方案

转录产物产量低

模板的质量与产量密切相关，实验组产量明显低于对照组可能原因有：

①实验模板中有抑制反应成分；

②实验模板本身原因。

建议：

①重新纯化模板；

②确定模板定量以及其完整性；

③延长反应时间；

④加大模板投入量；

⑤尝试其它的启动子和RNA聚合酶。

短转录本产量低

转录起始片段短会抑制反应，转录产物小于100nt 时，延长反应时间至 4-8 小时或增加模板量至2ug可以提高RNA产量。

RNA 转录长度大于预期

如果电泳显示产物条带大于预期大小，可能原因：

①质粒模板可能没有完全线性化；

②有义链3’端为突出结构；

③RNA存在未完全变性的二级结构。

建议：

①检查模板是否完全线性化，如有必要，额外进行线性化；

②选择合适的限制性内切酶，避免产生有义链3’ 端突出，或者用 Klenow Fragment 或 T4 DNA 聚合酶补齐后，再进行转录；

③使用变性胶检测RNA 产物。

RNA 转录长度小于预期

如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：

①模板包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；

②模板中GC含量高。

建议：

①降低反应温度（比如，30℃），有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的 RNA 聚合酶进行转录；

②若模板GC含量高，采用 42℃进行转录反应，或者添加 SSB 提高产量及转录长度。

转录产物电泳拖尾

电泳过程中有拖尾现象，可能原因：

①实验操作过程被RNase污染；

②DNA模板被RNase污染。

建议：

①实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O配制。

② 重新纯化模板 DNA。

本文摘自---药精通 Bio

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