1. PROTAC概念介绍

蛋⽩⽔解 ‒ 靶向嵌合体 (PROTAC) 已成为⼀种全新的药物发现模式，具有改变传统药物发现的潜⼒，并有可能成为新的重磅炸弹疗法。PROTAC 是双功能分⼦，由靶蛋⽩的配体、E3 连接酶的配体和连接linker组成，其目的不是抑制靶标而是诱导靶蛋白通过蛋⽩酶体系统被降解。

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Schematic of the PROteolysis TArgeting Chimera (PROTAC) technology. (Neklesa, 2017)

PROTACs 于 2001 年⾸次被报道用于作为⼈⼯靶向泛素连接酶复合物 Skp1-Cullin-F ^【1】。泛素蛋⽩酶体系统(UPS)和⾃噬/溶酶体途径是细胞内蛋⽩质降解和维持体内蛋白稳态的主要途径。

PROTAC 是⼀种双功能分⼦，可依赖泛素-蛋⽩酶体系统 (UPS)，以实现疾病相关靶蛋⽩的降解。蛋⽩质泛素化是⼀种 ATP 依赖的酶促反应，包括三个步骤和三种酶：泛素激活酶（E1 酶）、泛素结合酶（E2 酶）和泛素连接酶（E3 酶）。⾸先，泛素被 E1酶以 ATP 依赖性⽅式激活，然后活化的泛素被转移到 E2 酶，最后E3连接酶催化泛素从E2上以共价键方式转移到底物上。泛素是具有76个氨基酸的高度保守的肽段，包括7个赖氨酸残基和一个N端，每个赖氨酸都可以被泛素化，从而导致底物有单泛素化、多泛素化和多聚泛素化等情况，其中多聚泛素标记的蛋⽩可以被 26S 蛋⽩酶体识别并降解^【2】。

图1 泛素蛋白酶体系降解蛋白图解

2. 作用机制及优点

PROTACs 可以使自然情况下没有相互作⽤的两种蛋⽩质靠近，从而实现⼈为诱导的靶标降解。因此，PROTAC小分子的成功主要依赖于其结构中双分子对E3 连接酶和 POI 的高亲和⼒，与传统药物相⽐，降解 POI 不需要有任何功能活性。

PROTAC 的作⽤⽅式正在显着改变“可成药”的方式。传统意义上能否成药通常取决于是否可以设计可以结合空腔或⼝袋的⼩分⼦来抑制其活性，从⽽产⽣治疗效果。然而迄今为⽌，已知数以千计的蛋⽩蛋白相互作⽤ (PPI)没有深⼝袋，也没有明确定义的结合位点和只有平坦的蛋⽩界⾯，因此使用传统小分子研究PPI具有极高难度，因此PROTAC适⽤于靶向缺乏活性结合位点的转录因⼦或膜结合蛋⽩，此外PROTACs 的持久⽣物学效应与经典的受体依赖性药物相⽐具有显着优势(图2)。

尽管PROTAC分子具有相对较⼤的分⼦量，但它们可以维持⾜够的细胞内浓度，结合催化作⽤机制，成功地导致蛋⽩质降解。虽然细胞摄取的确切机制尚不完全清楚，但不同的 PROTACs在不同的细胞类型中均显⽰出细胞渗透是⼀被动过程^【3】。

LYTAC和AbTACs概念介绍

3. 降解剂类型

在蛋⽩酶体介导的蛋⽩质降解过程中，E3 连接酶是关键成分，目前已知有 600 多种 E3 连接酶，但迄今为⽌只有少数⼏种被⽤于 PROTAC。根据所使⽤的E3连接酶对PROTACs进⾏分类，最常⽤的有cereblon、Von Hippel Lindau (VHL)、 MDM2、cIAP1和其他降解剂（图3）。

图3 常用E3连接酶配体的结构

3.1 基于 Cereblon (CRBN) 的降解剂

沙利度胺及其衍⽣物来那度胺被定性为免疫调节药物（IMiDs），并已获得多发性⻣髓瘤的批准。从机制上讲，IMiD 靶向 E3 泛素连接酶 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN^【4】，IMiD 与 cereblon 的结合允许募集 IKAROS 家族（IKZF1 和 IKZF3）的转录因⼦并使得其内源性底物泛素化^【4】。2014年，沙利度胺结合的DDB1-CRBN配合物的晶体结构被解析后，基于 CRBN 的降解剂逐渐被开发，包括溴结构域和末端外 (BET) 蛋⽩ (BRD2/3/4)，FKBP12，BCR-ABL，BRD9，Sirt2，CDK9，FLT3，BTK, CDK4/CDK6等。

3.2 基于 Von Hippel-Lindau (VHL) 的降解剂

关于 VHL相关的PROTAC分子，最初是由HIF1-α 衍⽣肽段被替换为带有羟脯氨酸部分的⼩分⼦, 从⽽得到的 VHL ⾼亲和⼒和⾼特异性结合剂。基于⼩分⼦的 VHL-PROTAC 的例⼦已经可以有效降解多个蛋白：HaloTag 融合蛋⽩，致癌 BCR-ABL，BRD4，TBK1，⼏种酪氨酸激酶（EGFR、HER2 和 c-Met）和 TRIM24 等。

This PROTAC links BRD4 to the CRL2VHL ubiquitin ligase. CRL2VHL recruits a ubiquitin-loaded ubiquitin-conjugating enzyme (E2), which discharges its cargo onto BRD4.

《Protein degradation: Prime time for PROTACs.》

3.3 基于 MDM2 的降解剂

尽管与CRBN 和 VHL 相⽐，基于MDM2 的降解剂的研究相对较少，但仍然具有非常重要的科学意义。Nutlins 是与 MDM2 的 p53 结合⼝袋结合的配体，可以用来⽤合成破坏 MDM2 与转录因⼦ p53 的相互作⽤，⽽不影响 MDM2 的 E3 连接酶活性的PROTACs,2008,Crews等人合成了带有Nutlins片段的PROTAC分子，可以作为MDM2和SARM的配体,该分子可以成功进入细胞并将SARM募集到MDM2附近并被降解。

此外，他们设计合成了⼀种招募 MDM2 的 BRD4 降解 PROTAC-A1874，它由MDM2 配体- idasanutlin和 BRD4/BET 抑制剂- JQ1组成，值得注意的是，这是⾸次报道 E3 连接酶配体和靶向弹头产⽣的协同抗增殖作⽤，因为A1874能够降解 BRD4 并同时稳定 p53。

3.4 基于cIAP1 的降解剂

2010年,Hashimoto课题组公开了由甲基 bestatin (MeBS) 组成的全新 PROTAC的结构，它可以选择性结合 cIAP1 的 BIR3 结构域，其 RING 结构域可以促进⾃泛素化。基于 cIAP1的PROTAC 可以成功地诱导靶蛋⽩ CRABP-1 和 CRABP-2 的降解。

这一系列化合物的结构得到了进一步的优化和改进，将MeBS替换为cIAP1/cIAP2/XIAP的共同配体MV-1，实现了cIAP1 和 CRABP-2 的双蛋⽩敲低^【5】。

图4 基于cIAP1降解剂的结构优化

3.5 其他降解剂

发现新的降解诱导抑制剂对于扩展PROTACs的结构至关重要，2012年，Hedstrom 等⼈表明叔-氨基甲酸丁酯保护精氨酸（Boc3Arg) 部分可以诱导与其连接的配体的降解，并且该过程不依赖于 ATP 和泛素^【6】，其机制为Boc3Arg 连接的配体将靶蛋⽩定位到 20S 蛋⽩酶体，从⽽诱导降解。

4. 结构分析

图5化合物及蛋白共晶结构（左 Dbet1 右JQ1）

PROTAC发挥作用的关键步骤是形成⾼亲和⼒、持久的 E3 连接酶- PROTAC – POI三元复合物。⾼分辨率结构表明 PROTAC 分子dBET1与 BRD4 结合，且结合模式余抑制剂 JQ1相似 (PDB 4ZC9)（图5），此外2017 年，Ciulli 等⼈解析了第一个分辨率为 2.7Å 的三元配合物晶体结构 (PDB 5T35)。

PROTAC 分⼦ MZ1 由BET溴结构域抑制剂 JQ1 与高效且特异性强的 VHL 配体 VH032 (4) 和PEG linker组成。MZ1 与 Brd4 的第⼆个溴结构域 (Brd4BD2) 和 pVHL:ElonginC:ElonginB 存在⼴泛的疏⽔相互作用和干扰了蛋⽩-蛋⽩相互作⽤，VH032占据了VHL中脯氨酸的结合空腔，PEG linker与蛋白存在范德华作用力和氢键，此外，JQ1 和 VH032 配体的溶剂暴露区域埋在界⾯中，因为这两个蛋白质在空间上⾮常接近（图6）。总之共晶结构的发展为设计高亲和力，特异性强的PROTAC分子提供了可能。

计算机辅助设计已应⽤于 PROTAC 设计，以合理设计和优化双功能分⼦的结构。Drummond 和 Williams 最近的⼯作提供了较为清晰的总结^【7】。

图6 MZ1与蛋白的共晶结构（总体和局部放大图）

5. 三元复合物和动⼒学

PROTAC与抑制剂的区别之一在于PROTAC需要形成三元复合物，关于三元配合物的形成和随后的有效降解存在三种不同的可能性。发⽣有效降解的第⼀种可能性是形成稳定的三元复合物，这需要 POI 和 PROTAC 之间的⾼亲和⼒，以及与 E3 连接酶有稳定的相互作⽤。在第⼆种可能性中，虽然具有某种弱亲和⼒，但具有有利的相互作⽤，如果三元配合物稳定，降解也可能是有效的。相反，在第三种可能性中，⾼亲和⼒在没有有利相互作⽤的情况下会导致不稳定的三元配合物，因此降解是⽆效的。因此，PROTAC 适⽤于“困难”靶标，即已知抑制剂能够与靶标相互作⽤，但由于结合较弱，不适合进⼀步的临床开发或蛋⽩-蛋⽩相互作⽤，其中没有明确定义的⼝袋是⼀个典型特征。

关于动⼒学，PROTACs 也不同于经典小分子抑制剂。在多项 PROTAC 研究中，当使⽤⾼浓度时，经常观察到“hook effect”。在⾼浓度的情况下，容易产生非功能性的⼆元复合物 PROTAC: E3 连接酶和 PROTAC: POI而不是降解所需要的三元复合物。

6. Tau-PROTAC

Tauopathies 属于神经退⾏性疾病，具有异常形式的 tau 蛋⽩的特征性积累，导致局灶性⼤脑区域的神经元死亡，进而造成许多疾病的发生，例如阿尔茨海默病 (AD)，虽然确切的发病机制仍然难以捉摸，但有许多科研人员已经提出了⼀些猜想，例如β-淀粉样蛋⽩级联反应和致病性 tau 蛋⽩的形成。

曾有文献报道由 Tau 识别肽部分、细胞穿透肽和 E3 连接酶识别肽部分组成的多功能分⼦可以增强细胞中 Tau 的降解，并测试了多功能肽在⼩⿏神经⺟细胞瘤 N2a 的细胞系中诱导 Tau 降解的能⼒。其中化合物 TH006 效果最佳，共聚焦显微镜数据显⽰ TH006 能够进⼊细胞，且western blotting和流式细胞术的进⼀步分析证明它可以有效诱导了细胞内 tau 降解。

此外，20018年有文献报道了⼀种通过招募 Keap1-Cul3 泛素 E3 连接酶靶向 Tau 的PROTAC肽^【8】，这个多肽在Tau过表达的不同细胞系中均显⽰出能够进入细胞并诱导 Tau 降解，然⽽，基于肽的 PROTAC 和⼩分⼦ PROTAC 可能需要进⾏相当⼤的结构优化才能通过⾎脑屏障。

《Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway》

7. PROTAC发展史

PROTAC 蛋⽩质降解剂的概念由Proteinex于 1999首次报道，但后续没有继续深究^【9】。两年后，耶鲁⼤学的 Craig Crews发表靶向蛋白降解剂的相关研究文献，2008 年，Crews 和同事报告了第⼀个⾮肽的PROTAC，利用⼩分⼦招募 MDM2 作为 E3 连接酶来降解雄激素受体(AR)；2013 年，Crews 成⽴了Arvinas公司（康涅狄格州纽⿊⽂），将 PROTAC 技术逐步开发到临床；2017 年，Arvinas 选择⽤于前列腺癌的雄激素受体（AR）PROTAC 和⽤于乳腺癌的雌激素受体 (ER) PROTAC 作为⾸批临床试验候选者；2021年Arvinas的两个候选化合物（ARV-471和ARV-110）展开了临床二期的研究。

8. 总结

PROTACs在很多⽅⾯都没有遵循经典的药物发现规则，例如作⽤机制，动⼒学，三元配合物的形成，分子性质偏离Lipinski的五规则。然⽽，三元复合物的第⼀个晶体结构的解析以及动⼒学研究显着提⾼了我们对这种新模式的理解，并且PROTAC分子已经为许多具有挑战性的靶标积累了许多有效的临床前数据，包括 Tau 蛋⽩、雄激素和雌激素受体。与其他蛋白降解的技术（例如⽤于癌症治疗的 CRISPR 和 RNAi）相⽐，PROTAC 具有与靶标可逆结合的优势，这种效应不是永久性的，因此与 CRISPR 相⽐，预期的脱靶效应更少。

PROTACs的一个局限性是它主要针对细胞质或细胞核内蛋白，无法靶向细胞外蛋白，但让人兴奋的是，2019年Crews团队设计了一种ENDTAC分子，通过利用细胞的内吞作用（endocytosis）实现靶向降解细胞外蛋白。总体⽽⾔，PROTAC 代表了⼀种新的药物发现模式，具有改变传统药物发现的潜⼒。

https://doi.org/10.1021/acscentsci.9b00224

参考文献：

【1】2019. PROTACs– a game-changing technology. Expert Opinion on Drug Discovery 14, 1255–1268.

【2】Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc Natl Acad Sci. USA. 2001;98(15):8554–8559.

【3】Kaiser, P., Huang, L., 2005. None. Genome Biology 6, 233.

【4】Churcher, I., 2018. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Journal of Medicinal Chemistry 61, 444–452.

【5】2012. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia 26, 2326–2335.

本文摘自---药精通 Bio