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从技术上看，分子诊断领域主要包括PCR（传统PCR、qPCR和dPCR）、荧光原位杂交（FISH）、基因芯片和第二代高通量测序技术（NGS）等。其中，PCR是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率高达40%；其次是分子杂交技术，占比为35%。

1. 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

上世纪八十年代，Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，对分子生物学乃至整个生命科学界产生了巨大的推动作用。从此以后，基于PCR的DNA扩增技术逐渐成为生物学研究的基础，开启了一个又一个生命科学领域的重大课题。目前，PCR在传染性疾病（细菌、真菌、病毒、支原体）诊断、NIPT、干细胞研究、生物标志物开发等方面有着极为广泛的应用。

PCR是指在DNA多聚酶（又称“DNA聚合酶”，如Taq DNA聚合酶）催化条件下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过高温变性（94℃）、低温复性（55℃）、中温延伸（72℃）等步骤，在体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR是生物体外的特殊DNA复制，最大的特点是能将微量的DNA大幅扩增。

与杂交技术、高通量测序技术相比，PCR技术主要优势在于高灵敏度、易于推广，主要局限在于检测位点单一且已知，多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。但从短期来看，PCR技术仍将是分子诊断主流技术平台。

PCR技术自问世以来，经历了三十余年的高速发展，目前已经成为世界上应用最成熟、市场份额最大的分子诊断技术平台。研究者们在该技术原理基础之上开发出一系列衍生的分子检测技术，主要可以分为三类：第一代PCR电泳法、第二代荧光定量PCR（qPCR）和第三代数字PCR（dPCR）。

1.1 PCR电泳法（传统PCR）

PCR电泳法是最原始、最简单的基于凝胶的低通量PCR方法，是指在PCR反应结束之后，通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，利用长波式紫外灯照射或放射自显影技术对PCR扩增产物进行定性检测分析的DNA检测方法。但PCR电泳法本身只能做定性检测而无法定量，因为该反应产出的DNA量不一定能反映最初情况，例如不同样品和序列的扩增效率是有差异的。此外，还存在交叉污染、检测耗时长等缺点，目前处于衰退期，基本上已被淘汰。

1.2 qPCR电泳法（荧光定量PCR）

qPCR是利用插入性染料或荧光探针对PCR产物进行标记跟踪，通过监控整个PCR过程中荧光信号的强度变化得到待测DNA样本初始浓度的相对定量分析方法。该方法相较于传统PCR方法而言，无需取出PCR产物进行分离，且可作定量分析，并具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、无污染等优势，目前已逐渐取代常规PCR，成为应用最成熟、临床应用最广泛的分子诊断技术平台。

根据引入荧光基团的不同，qPCR可分为荧光探针法定量PCR和荧光染料法定量PCR。

荧光探针法定量PCR的原理为：在PCR反应体系中，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这就是定量的基础所在。

荧光染料法定量PCR的原理为：在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合并发射荧光信号，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，此即定量的基础所在。

qPCR在国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台，尤其是在感染性疾病（HBV、STD等）和肿瘤伴随诊断领域，目前仍以qPCR技术平台为主。据不完全统计，截至2020年5月11日，国家药监局（NMPA）共批准了806个PCR类产品，其中荧光定量qPCR产品占比高达85.11%。在伴随诊断领域，NMPA获批的伴随诊断产品中有60%都是基于qPCR技术，而FDA批准的39个伴随诊断产品基于qPCR技术的产品占比也高达38.46%（15个）

1.3 dPCR（数字PCR）

dPCR是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术，主要采用当前分析化学热门研究领域的微滴化方法，对待测样本进行高倍稀释，分配到不同的反应单元内，每个单元或不含有、或含有一至多个目标分子（DNA模板），再将所有反应单元内的样本进行PCR扩增，最后结合泊松分布原理，分析软件根据阳性分子个数与比例得出靶分子的起始拷贝数（copies）或浓度（copies/uL）。与qPCR相比，dPCR具有绝对定量、高灵敏度、可耐受PCR反应抑制物、减弱背景序列干扰信号等显著优势。

dPCR在国内尚处于市场导入期，目前仅有南京科维思生物的HER2基因扩增检测试剂盒（数字PCR法）获批，在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传染病检测、NIPT、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文数据显示，中国dPCR行业市场规模从2013年的14.6亿元增加至2017年的72亿元，CAGR达到29.2%，到2022年市场规模预计将达到266.6亿元。

2.  荧光原位杂交（Fluorescence In-Situ Hybridization，FISH）

FISH是一种按照核酸碱基互补配对原则，利用荧光素标记的、已知序列的DNA探针直接原位杂交到待测DNA样本模板上，经荧光检测系统和图形分析技术对待测DNA序列进行定位、定性和相对定量的技术。FISH主要用于指导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断、NIPT等领域，是检测HER-2基因（一种原癌基因）状态的金标准，目前在国内发展较为成熟，且国内大多数省份和地区均已将其纳入医保。

FISH操作流程为：首先用荧光素（直接标记法）或“生物素-荧光素标记亲和素”放大系统（间接标记法）标记探针核苷酸，利用切口平移法或随机引物法制备出带有荧光标记的、已知序列的DNA探针。在高温条件下使该探针与待测DNA样本模板发生变性并打开双链，令两者混合杂交并形成杂交体，最后通过荧光显微镜进行观察，从而实现对目标DNA的定性、定位和相对定量分析。

3.  基因芯片技术

基因芯片技术又称DNA微阵列技术，是将大量荧光或酶标记的、序列已知的DNA探针集成在同一芯片上与样品分子进行杂交，通过采集荧光或化学发光信号获得样本序列信息。基因芯片技术可看作是FISH与芯片技术的结合，可以实现对大量目标基因同时进行检测，具有成本相对较低、检测效率较高的优势，主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、遗传基因和肿瘤基因检测等领域。

NGS又称为下一代测序技术，是指通过模板DNA分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在DNA聚合酶链反应或DNA连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读。NGS最显著特征是高通量，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。该技术不需要荧光标记的核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

罗氏454生命科学公司于2007年推出的GS FLX测序系统，是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。

随着NGS技术进步和测序成本的降低、肿瘤医生和病人对NGS检测认知不断完善、测序服务对象和应用细分领域的拓展、企业间合作的增加，NGS有望迎来快速发展。根据美国 Markets and Markets报告显示，预计全球高通量基因测序市场规模将从2019年的78亿美元增加至2025年的244亿美元，CAGR为20.9%。