2.1.1. 全基因组测序

全基因组测序 (WGS) 是一种强大且全面的基因组分析技术，涉及确定个体基因组的完整 DNA 序列。它提供了个体基因构成的详细蓝图，包括其基因组中存在的所有基因、调控区域和非编码元件。它主要应用于发现科学，例如植物和动物研究、癌症研究、罕见遗传疾病、复杂疾病症状的患者、群体遗传学以及真核生物和原核生物的新基因组组装。通过对生物体基因组中的所有 DNA 进行测序，WGS 能够识别遗传变异，范围从单核苷酸多态性 (SNP) 到插入、缺失和重排等更大的结构变化。通过全基因组测序获得的大量信息在各个领域提供了多种应用。全基因组比更小范围的基因测序成本高，因为全基因组相当于大约3.3x10 9个碱基，即3.3个碱基(gigabase, Gb)。随着成本降低以及获得更多关于编码非DNA在人类疾病中作用的信息，全基因组测序可能比外显子测序更可获取。另外，全基因组测序可用于检测通常只能通过阵列基因比较组杂交(array Comparison基因组杂交，aCGH)检测的缺失并且重复，因此可以减少对其他补充检测的需求。

2.1.2. 全外显子组测序

外显子组包含编码蛋白质的基因，仅占基因组的1.5%-2.0%，即大约30兆碱基(megabase, Mb)。剩余的非外显子区域包括内含子，以及控制基因功能其他方面（如剪接和基因表达水平）的调控序列。85%以上的已知突变是在外显子中发现的，因此某些临床情况中可以采用外显子组测序。与全基因组测序相比，该方法可大幅降低成本和数据存储要求。显着子组简化了临床报告，因为大多数情况下显着子变异的意义更容易解读。外显子组缺失对全基因组缺失的主要预测是，外显子组缺失可能遗漏基因组非编码区的危险性变异。因此，如果最终外显子组缺失无法诊断，某些情况下可考虑全基因组测序。

全外显子组测序 (WES) 是一种测序方法，专注于捕获和测序基因组的蛋白质编码区域（称为外显子组）。通过对外显子组进行测序，WES 能够识别蛋白质编码基因内的遗传变异，包括单核苷酸变异 (SNV)、插入、缺失和拷贝数变异 (CNV) 。对于具有一系列症状的罕见临床疾病，以及识别群体和癌症遗传学变异，WES 是 WGS 的一种经济高效的替代方案 。WES 涉及使用混合捕获或目标特异性扩增技术富集外显子区域，然后进行高通量测序。NimbleGen、Agilent、Illumina、Twist 和 IDT 提供与 Illumina NGS 平台兼容的各种外显子组捕获检测方法。WES 数据分析所用的生物信息学方法与 WGS 相同，因为 WES 是 WGS 的一部分。

由于据报道绝大多数疾病变异位于编码区，WES 目前是孟德尔疾病基因诊断的一线方法。诊断率的提高促进了医疗成本的降低以及患者质量和结果的改善。然而，尽管生物信息学方法有所改进，但诊断率仍然很低且不稳定，仅为 25-50%，使得很大一部分人等待基因诊断 。WES 的局限性包括解释未知意义变异 (VUS) 的不断出现的挑战，包括尚未与任何疾病相关的基因变异，以及 WES 识别结构重排、拷贝数变异和串联重复扩增的功效有限。以及基因组中富含 GC 和 AT 的区域。此外，尽管之前由于研究偏差和通过使用严格的过滤技术而被排除，同义、内含子和非编码变异也可能是致病的。有证据表明，9-30% 的致病变异位于非编码区域，并且存在与 50 多种不同疾病相关的同义变异。这表明审查这些被忽视的变异类别变得越来越重要。

随着NGS变得越来越便宜，诊断实验室也越来越容易使用，更全面的WGS技术将变得更加突出，因为它可以对非编码区域进行测序。然而，庞大的数据量带来了巨大的生物信息学挑战，即解释每个样本 300 万个 SNV，然后进行额外的功能验证。导致当前方法生物信息学困难的一种特殊类型的变体是剪接变体。据报道，这些变异占致病变异的 10%，这一数字据推测被低估了。这些突变的后果可能导致外显子产生、跳跃、截断、延伸和内含子保留。这些在调查 WES 和 WGS 数据时带来了分析挑战。尽管可以使用这些技术来识别规范剪接突变，但神秘位点和增强子位点仍然带来解释挑战。此外，绝大多数内含子变异根本无法被 WES 识别，而它们的数量太多，无法从 WGS 数据中进行优先排序，并且大多数情况下仍保留为 VUS。因此，当今临床医生和科学家面临的挑战发生了巨大的转变，不再能够对基因组进行全面测序，而是更多地转向解释它们生成的大型数据集并将这些信息转化为可操作的结果。此外，发现的大量 VUS 凸显了随着新疾病基因的出现重新过滤 NGS 数据的重要性。最近，基于 RNA 测序的转录组学开始成为遗传诊断的主要参与者，以帮助注释和解释这些类型的变异。

2.1.3. 靶向测序

顾名思义，靶向测序的探索能力不如 WGS 或 WES，因为它针对基因的特定区域，并且能够拾取各种类型的遗传变异，从 SNV 到小基因删除、重复、插入或相关的基因重排。具有疾病表型。然而，其优势包括成本效益和临床医生可管理的数据，通过更具体的疾病相关信息使临床决策变得更容易。对于遗传疾病中的罕见等位基因，以及由于肿瘤异质性或癌症疾病进化而产生的低丰度进化突变克隆，它可以提供高达 5000× 的更深覆盖率。候选基因方法或商业化的靶向panel是在人群规模上开展的WGS/WES项目的结果。种系以及体细胞变异可以使用靶向 NGS 组合进行测试，靶向面板采用简单的富集方法，通过使用区域特异性寡核苷酸引物池进行扩增。然后对产生的特定大小的文库进行测序并进行生物信息分析。

2.2 转录组学

全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）是罕见疾病基因诊断的前沿方法。然而，WES/WGS 在高达 75% 的情况下会失败。RNA 测序转录组学 (RNA-Seq) 是一种新方法，旨在提高罕见疾病的诊断率。新一代测序 (NGS) 对转录组学产生了变革性影响，彻底改变了我们研究转录组（有机体或特定细胞群中完整的 RNA 分子集）的能力。NGS 技术提供了高通量且经济有效的方法来分析和分析 RNA 分子，使研究人员能够深入了解基因表达、选择性剪接、非编码 RNA 调控以及各种生物过程和疾病。mRNA 测序 (RNA-Seq)：RNA-seq 是转录组学中广泛使用的 NGS 应用。它涉及 mRNA 分子的测序和定量，提供生物样本中表达基因的全面快照。通过生成数百万个短测序读数，NGS 使研究人员能够准确识别和量化基因表达水平。可以分析 RNA-seq 数据以检测不同条件之间的差异基因表达，发现新的转录本，评估可变剪接事件，并研究随时间变化或跨不同组织或细胞类型的基因表达动态。

选择性剪接分析：选择性剪接是单个基因可以生成多种 mRNA 亚型的过程，它显着增加了转录组的复杂性。NGS 提供了全面研究选择性剪接模式的能力。通过将 RNA-seq 读数与参考基因组进行比对，研究人员可以识别剪接点并检测替代剪接事件。这些信息可以对转录亚型进行量化和表征，从而深入了解亚型多样性、组织特异性表达以及选择性剪接的功能影响。

长非编码 RNA (lncRNA) 和小 RNA 分析：NGS 促进了非编码 RNA 的研究，非编码 RNA 在基因调控中发挥着关键作用。小RNA测序和长非编码RNA测序等技术能够鉴定和表征各类非编码RNA。小 RNA 测序可以对小调控 RNA（包括 microRNA、piRNA 和 snoRNA）进行分析，从而深入了解它们在转录后基因调控中的作用。长非编码RNA测序能够识别和分析长非编码RNA转录本，这些转录本与多种生物过程和疾病有关。长 RNA-seq 读数可以了解多个外显子之间的连接性并揭示转录区域中的序列变异 (SNP) 。小 RNA 测序是一种非靶向方法，可以检测新型 miRNA 和其他小 RNA 。癌症生物学中 ChIP-seq 转录组研究有助于了解 ncRNA（例如 sncRNA 和 lncRNA）在癌发生/癌症进展过程中基因调控机制中的新兴作用。

转录组组装和注释：NGS 数据可用于重建和注释生物体的转录组。通过将 RNA-seq 读数与参考基因组进行比对或使用从头组装方法，研究人员可以识别新的转录本、剪接变体、非翻译区域和其他转录本特征。这些信息增强了我们对转录组复杂性的理解，并改进了参考基因组的注释，从而能够发现以前未知的基因和调控元件。

单细胞转录组学：NGS 促进了单细胞转录组学的出现，使得在单个细胞水平上研究基因表达谱成为可能。单细胞 RNA 序列 (scRNA-Seq) 技术可以对单个细胞的转录组进行分析，从而深入了解细胞异质性、细胞类型识别、细胞谱系分析以及复杂组织或发育过程中的基因表达动态 。

整合转录组学：转录组学的 NGS 数据可以与其他组学数据（例如基因组学、表观基因组学和蛋白质组学）整合，以获得对基因调控和生物过程的全面了解。综合方法提供了分子相互作用的系统级视图，并能够识别细胞过程和疾病背后的关键调节机制。

2.3 表观基因组学

表观基因组学是指对表观遗传修饰的研究，表观遗传修饰是基因表达模式的可遗传变化，不涉及 DNA 序列的改变 。研究的最常见的表观遗传修饰类型是 DNA 甲基化 、组蛋白修饰和 RNA 甲基化（表观转录组）。这些化学标签反过来会改变 DNA 可及性、染色质重塑和核小体定位 。这些修饰受到营养物、污染物、毒物和炎症等环境因素的影响。通过人类、植物和动物的全基因组测序产生的知识和数据，帮助科学家更好地了解这些表观遗传改变，特别是DNA甲基化和羟甲基化。表观遗传改变引起了研究人员和临床医生对行为障碍、记忆、癌症、自身免疫性疾病、成瘾、神经退行性疾病和心理障碍等复杂疾病的兴趣。开发了各种平台和测定方法来研究表观遗传修饰，这些平台和测定方法在其他地方已经得到了很好的描述。NGS 已用于研究表观基因组学，如下所述：

DNA 甲基化分析：DNA 甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在基因调控和细胞过程中发挥着关键作用。NGS 能够以单核苷酸分辨率对全基因组 DNA 甲基化模式进行分析 。全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 和简化代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 等多种策略利用 NGS 来识别甲基化胞嘧啶 。然而，RRBS 基于使用限制性酶消化富集甲基化基因组区域。这些方法使研究人员能够研究 DNA 甲基化动态，发现与疾病相关的差异甲基化区域 (DMR)，并了解甲基化对基因表达的影响。

染色质可及性图谱：基于 NGS 的技术，例如使用测序 (ATAC-seq) 和 DNase-seq 检测转座酶可及染色质，可以对染色质可及性进行全基因组分析。这些方法可识别 DNA 结合蛋白和转录因子可接近的基因组区域，从而深入了解基因调控元件、增强子和启动子。通过将染色质可及性数据与其他表观遗传修饰、基因表达数据和转录因子结合数据相结合，研究人员可以解开基因组内的功能元件。

组蛋白修饰分析：组蛋白修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化等，是调节染色质结构和基因表达的关键表观遗传标记。染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 通过基于抗体的蛋白质下拉，然后富集与蛋白质结合的 DNA 并进行测序，可以对组蛋白修饰进行全基因组分析。该技术可应用于许多不同的研究领域，例如转录因子 (TF) 结合位点识别、DNA 组蛋白修饰分析和 DNA 甲基化。为了研究组蛋白修饰，使用针对组蛋白修饰的抗体来拉取 DNA 并使用 NGS 技术进行测序。所得读数与参考基因组进行比对，从而能够识别特定基因组区域的组蛋白修饰模式。ChIP-Seq 可以深入了解基因表达的表观遗传调控、染色质状态以及增强子和其他调控元件的识别 。

染色质构象分析：基于 NGS 的技术（例如 Hi-C 和 4C-seq）可以研究 3D 染色质组织和相互作用。这些方法捕获长程染色质相互作用并能够构建染色质相互作用图谱 。通过将 3D 染色质构象数据与表观遗传修饰、基因表达数据和功能注释相结合，研究人员可以深入了解基因组的空间组织并了解它如何影响基因调控。

除了这些独立的方法之外，表观基因组学的 NGS 数据还可以与转录组学数据相结合，以揭示表观遗传修饰和基因表达之间的关系。DNA 甲基化谱与 RNA-seq 数据的整合可以识别与基因表达变化相关的差异甲基化区域 (DMR)。将组蛋白修饰和染色质可及性数据与 RNA-seq 相结合，可以识别与特定基因表达模式相关的调控元件，并探索表观遗传调控机制。

RNA测序局限性：尽管RNA成功地将诊断率提高了 7.5-36%，但 RNA-Seq 的局限性仍然存在。最突出的挑战是找到基因表达的组织特异性与组织采集的可及性和侵入性之间的适当平衡。人一生中基因表达的变异性是 RNA-Seq 的另一个考虑因素。尽管已有大量资源，但仍然需要涵盖各个年龄段的更全面的基因表达数据集。